שיטת מחקר גנטית מולקולרית

כדי לחקור ולזהות גרסאות בשיטה גנטית מולקולרית בשימוש מבנה ה- DNA. עבור כל אזור ה- DNA, אשר בוחן באזור זה של כרומוזום, גן או אלל, בשיטות שונות. ביסוד כל שיטה גנטית מולקולרית מורכב מכ או מניפולציה אחרת של רנ"א ודנ"א. כל השיטות הללו מאופיינות למורכבות עצומה, ללא תנאי מעבדה לא יכולים להתבצע, וצוות חייב להיות מוכשר. עבודה זו מתבצעת בכמה שלבים.

בשלבים

ראשית, דגימות RNA או DNA כדי להיות מיוצר. כאן, שיטה גנטית מולקולרית ניתן ליישם כמעט כל חומר: טיפת דם, לויקוציטים, הפיברובלסטים תרבות, רירית (מגורד), אפילו את זקיקי השיער, - DNA ניתן להשיג מכל מדגם. היא מתאימה לשימוש בכל שיטות גנטיות מולקולריות ואפשרויות השונות שלהם יש DNA ארוך מבודד המאוחסן קפוא. השלב השני מוקדש ההצטברות של שהברים הרצויים (הגברה) של ה- DNA, כפי שהיא מסייעת להבטיח את תגובת השרשרת של פולימראז במבחנה (in vitro ללא מעורבות של אורגניזם חי). כתוצאה מכך, מתרבה קטע DNA שנבחר על ידי תגובת שרשרת זו, ואת הסכום של עליות DNA ממש מ'פעמים.

השלב השלישי שיטות מחקר גנטי המולקולריות הנחה הוא הגבלת DNA מוכפלת (הפיצול הזה, קורעים או חיתוך). הגבלה בביצוע אלקטרופורזה על polyacrylamide או ג'ל agarose. שיטה מולקולרית-גנטית זו של לימוד קטע DNA מאפשרת לכולם לנקוט בעמדה מסוימת בתוך הג'ל. לאחר מכן, הג'ל מטופל עם ברומיד ethidium, מסוגל מחייב DNA, הקרנת אור אולטרה סגול, אז אפשר לצפות בחלקי הארה. שיטות אבחון גנטיות מולקולריות הן מגוונות ורבות, אבל את שני השלבים הראשונים משותפים לכל. אבל כדי לזהות שברי DNA, הג'ל ניתן צבעוני, ורבי שיטות קיימות אחרות.

מינים

השיטות הישירות והנפוצות ביותר עבור mycobacteria באיתור עשויות לכלול את שיטת למידת DNA הגנטי המולקולרית לעיל. מהותו היא כי, על מנת לזהות את חומר שרשרת הסריקה של שברים ספציפיים של DNA של פתוגנים. טכניקות אבחון גנטיות מולקולריות עדיין אין דרך יעילה יותר כדי לזהות מחלות כגון שחפת. באמצעות תגובת השרשרת של פולימראז (PCR), אתה יכול להיות בטוח כי ה- DNA המקורי יגדיל את מספר העותקים מ'פעמים, כלומר, יהיה הגברה, והוא יציג את התוצאות. רמת הרגישות היא גבוהה מאוד - יותר מתשעים וחמישה אחוזים, וזה היתרון העיקרי של שיטה זו.

שאר השיטות מולקולריות-הגנטיות של מחקר על האפקטיביות של מספר עותקי תשואה ממש הוכפל, שכן במקרה זה מדגם בניסוח מציג רצף oligonucleotide ספציפי גדל עד מאה שש פעמים. גם אבחנת התרבות של שחפת של מערכת הנשימה תחתונה הרגישה שלה באופן משמעותי. זו הסיבה מדוע הרפואה המודרנית מבוססת על שיטות גנטיות מולקולריות של אבחנה של שחפת. שיטה מתוארת היא יעילה במיוחד כאשר התמודדות עם פתוגנים של השתנות אנטיגני גבוהה, לקבוע כי דרך אחרת היא הרבה יותר קשה - דורשת מיוחד תזונתי וטיפוח זמן רב. שיטות גנטיות ביוכימיים ומולקולריים לייצר אפקט שונה מאוד על התוצאות.

אבחנה של שחפת

אבחנה של שחפת מרשל PCR לרוב באמצעות אלה רצפי DNA ספציפיים עבור כל ארבעת סוגי המחלה. כדי להשיג מטרה זו מרבים להשתמש פריימרים שמזהים רצף IS אלמנטים (IS-986, IS-6110), כמו אלמנטים אלה לאפיין מינים לנדוד שחפת Mycobacterium ו עותקים מרובים ההווה תמיד בגנום. כמו כן מיצוי DNA יכול להתבצע מתרבויות טהורות קלינית (ליחה של חולים) בכל שיטה מתאימה אחרת. לדוגמה, יש שיטה בום שבו חיץ תמס משמש מבוסס על thiocyanate guanidine ו סיליקה כמו ה- DNA המוביל. מספר המטופלים השונים בקטריולוגית העניים גדל מדי שנה, ולכן בקליניקה הקימה ברמה אחרת לגמרי של הארגון: שיטה מולקולרית-גנטית של לימוד DNA כבר משחק תפקיד מרכזי האבחון.

עם זאת, אנו חייבים להודות שזה לא בלי חסרונות. שיטת PCR היא השימוש קרוב מביא מספר עצום של תוצאות חיוביות שגויות, והסיבה היא לא טעויות טכניות בלבד, אלא גם את התכונות של השיטה עוצמה. בנוסף, בשיטה זו של אבחון כדי לקבוע את הכדאיות של mycobacteria, אשר זוהה, זה פשוט בלתי אפשרי. אבל החיסרון הזה הוא לא החשוב ביותר. שיטות גנטיות מולקולריות של אבחון PCR כרוך בסיכון לזיהום DNA mycobacterial. דרישות הסמכה מסיבה זו למעבדות PCR תוכננו קשה בלעדי, הם דורשים שלוש הנחות נפרדות. טכנולוגית PCR היא מודרנית מאוד מורכבת, זה מחייב שימוש בציוד מתאים ואנשים היי-מאומן.

bacterioscopy

כאשר תוצאות האבחון של הניתוח חייבות להיות לעומת נתונים אחרים: בדיקה קלינית, רדיוגרפיה, למרוח מיקרוסקופיה, יבול ואפילו בתגובת טיפול ספציפי מאוד חשובים. בסדרה זו, מחקרי PCR הוא רק אחד המרכיבים. זיהוי הפתוגן באבחון מוקדם יכולה להיות שיטות הפשוטות ומהירות - בקטריולוגית.

יש משמש מיקרוסקופ אור (צביעה Ziehl-Neelsen) ו פלורסנט (fluorochromes צביעה). היתרון הוא מהירות למרוח את התוצאות. אבל החיסרון שלה נחשב בצדק הקיבולת המוגבלת בשל רגישות נמוכה. עם זאת, שיטה זו ניתנת המלצת WHO בתור החסכוני ביותר ואת הקרקע כדי לזהות חולי שחפת. איתור של שיטת mycobacteria בקטריולוגית יש ערך חיזוי והעריכה הפרשת חיידקים כמותית. הרבה יותר בטוח להתמודד עם זה שיטות מחקר גנטיות מולקולריות של שחפת.

תרבויות

זיהוי טוב יותר של mycobacteria להכיר בלימודי תרבות. זורעי חומר פתולוגי הוא עשוי לתוך מדיום הביצה: Mordovsky, הפין שני, LJ, וכדומה. Benchmarks של התנגדות של mycobacteria לתרופות וראיות עקיפות של האפקטיביות של מספר mycobacteria ו המושבות שלהם במבחנה, אם השיטה המיושמת של תרבות מחקר. כדי להגדיל את אחוז הבידוד של חיסון mycobacteria של חומר פתולוגי מוחזק על סביבות מרובות.

מתן מענה לצרכימים של כולל מענק ונוזלים תרבותיים, הפתוגן רב. בשימוש במערכת זו וצמיחת VANTES סוג המדידה אוטומטית. גידולים חייבים שיתקיימו דגירה של עד שבעה עד שמונה שבועות. בשלב זה היבול עם חוסר הצמיחה יכול להיחשב שלילי. הדרך היעילה ביותר כדי לזהות שחפת Mycobacterium לשקול דגימות ביולוגיות: שרקנים להדביק חומר אבחון, אשר הם מאוד רגישים TB.

דמויות מסוימות

תחום מעניין של המחקר, אשר נפתח על ידי אבחון PCR היה ללמוד את שחפת - זיהום לטנטי. התפיסה המודרנית של זיהום שהחפת עולה כי מתוך מאה אנשים שהיו במגע עם שחפת, תשעים עשויים בהחלט להיות נגועות, אבל רק עשרה מהם המחלה פעילה מפותחת. לאחרים יש TB חסינות, ובגלל תשעים אחוז מהמקרים הזיהום נשאר רדום. זיהוי דפוס זה סייע שיטה גנטית מולקולרית.

גנטיקאים אומרים שבעוד חמישים וחמישה אחוזים מאותם גידולים שלחומר פתולוגי היו שליליות, ושמונים אחוז נשאי שחפת, אבל זורם עם שום גילויי רדיוגרפי של המחלה, התגובות חיוביות PCR קיבל. זוהי שיטת אבחון גנטית עזרה לזהות חולה בסיכון על ידי מחקרי PCR, עם התוצאות של הניתוחים שלהם (מיקרוסקופיה ותרבות) היו שלילית, ואת הזיהום תת-קליני שהחפת נכחה.

מחקר מודרני

הפדרציה הרוסיה מעבדות בקטריולוגיות להשתמש בשיטה מואצת של ריכוזי מוחלט: פעילות רדוקטאז חנקה של mycobacteria נבדק על ידי ריאגנט Griess. מרכזי Anti-TB להשתמש בשיטה המאפשרת לקבוע עמידות לתרופות. זריעה זה בתקשורת נוזלית, שבו אוטומטי רדיומטרי וצמיחת מערכת חשבונאי פלורסנט של mycobacteria. ניתוח כזה מתבצע במהירות - עד שבועיים.

נכון לעכשיו, שיטות חדשות מפותחות: עמידות לתרופות של mycobacteria נמדדת ברמת הגנוטיפ. לחקר המנגנונים המולקולריים של גנים התנגדות ומראה נוכחות ב mycobacteria. גנים אלו קשורים עם עמידות לתרופות מסוימות. לדוגמא, גני קאסה, inhA, katG עמיד איזוניאזיד, גן rpoB - גני RNA 16Sp ריפמפיצין ו rpsL - סטרפטומיצין, emb1 - כדי ethambutol, gyrA - A fluoroquinolone וכן הלאה.

מוטציות

האבחנה המודרנית גדילה משמעותית את השיטה ברמה המולקולרית-גנטית לחקר DNA ואפשרה לבצע מחקרים בקנה מידה גדולה של מוטציות בכל הספקטרום שלהם. עכשיו אנחנו יודעים כי המוטציות השכיחות 516, 526 ו 531 קודונים גן rpoB, וזיהו את העמידות לתרופות שונות. ישן מגוון רחב של שיטות ההקלדה של mycobacteria באמצעות לא רק שיטות מסורתיות - ביוכימיים, ביולוגית והתרבותית, אלא גם בשימוש נרחב בטכניקות גנטיות מולקולריות מודרניות. כבר יש מספיק ולספק את שיטת האבחון הנכון עבור זיהוי של מחלות מונוגניות. הם מבוססים על מחקרי DNA באזור המדויק של גן מסוים. בדרך כלל זהו תהליך מורכב, זמן רב ויקר, אך הנתונים מסופק על ידי ניתוח גנטי מולקולרי, הוא הרבה יותר מדויק ואינפורמטיבי יותר נתונים של כל הניתוחים האחרים.

זה כבר זמן רב ידוע כי ה- DNA לא משתנה עבור כל תקופת החיים של האורגניזם שזה בכל odnakova תאי בעלי גרעין, וזה מאפשר לקחת את הניתוח לחלוטין את כל תאי הגוף, בכל שלב של ontogeny. את הגן הפגום יכול להתגלות לפני הופעת התסמינים הראשונים של המחלה הקלינית בהיקף מלא, כמו גם אצל אנשים בריאים הטרוזיגוטיים, אך בעל מוטציה בגן. שיטות גנטיות מולקולרית של אבחון של מחלות תורשתיות יכול לזהות אותו (גישה ישירה, DNA-אבחון), כמו גם לנתח את ההפרדה של המחלה במשפחה עם דנ"א לוקוסים סמן (פולימורפיזם גנטי), אשר מתקיים קשר הדוק עם הגן הפגום (כלומר, הגישה העקיפה לאבחון DNA). באופן ישיר או עקיף - כל אבחון DNA מבוסס על השיטות לזיהוי חלק מוגדר מאוד של DNA האנושי.

שיטות ישירות

שיטות ישירות של אבחון דנ"א הן כאשר תורשתית למחל גן האשם ידועה, כמו גם ידוע, וסוגים של המוטציות שלו. לדוגמא, שיטות ישירות מתאימות למספר מחלות. זה מחולית הנטינגטון (סיומת CTG-חזרות), פנילקטונוריה (R408W), סיסטיק פיברוזיס (delF508, שמוטציות גדולות) וכדומה. היתרון העיקרי של השיטה הישירה הוא דיוק באבחון בבעלות מלאה, ואין צורך לעשות ניתוח דנ"א של שאר בני המשפחה. אם מוטציה בגן המתאים נמצאת, זה מאפשר בדיוק לאשר אבחנה של תורשה, נחישות הגנוטיפ עבור שאר בני המשפחה העמוסה.

יתרון נוסף של אבחון ישיר נחשב לזהות ספק הטרוזיגוטיים של מוטציות רעות מקרובים והורים שמתו מהמחלה. הדבר נכון במיוחד עבור מחלות אוטוזומלית רצסיבית. חסרונות של שיטות ישירות גם זמינים. כדי ליישם אותם, אתה צריך לדעת בדיוק למקם את הגן הנורמלי, אקסון-אינטרון מבנה הספקטרום שלה והמוטציות שלה. לא כל מחלות מונוגניות היום קיבלו מידע כזה. האינפורמטיביות שיטות ישירה לא יכול להיחשב שלם, כי היינו הך הגן עשויה להיות מספר רב של מוטציה פתולוגי שגורם להתפתחות של מחלות תורשתיות.

שיטות עקיפות

עקיפות שיטות אבחון DNA משמשות בכלל, במקרים אחרים, אם את הגן הפגום הוא לא זיהה, אבל רק כרומוזומלית, או אם אבחנת הקו לא נתנה את התוצאה (זה קורה, אם הארגון המולקולרי המורכב הגן או במידה רבה, אם יש הרבה מוטציות פתולוגי). שיטות עקיפות ביצע ניתוח הפרדה של סמנים פולימורפיים במשפחה אללים. סמנים נמצאים כרומוזומליות באזור או לוקוס אותה קשורים קשר הדוק המחלה ולייצג מחיקות או הוספות, החלפות נקודה, חזרות, פולימורפיזם שלהם נובע כמות שונה של תאים בגוש.

רוב נוח פולימורפיזם microsatellite עקיף נחשב אבחון minisatellite, אשר מופצים באופן נרחב בגנום האנושי. ערכם לידי ביטוי בתוכן מידע גבוה, אם ניזק המרחק הגנטי בין סמן ואת הגן הוא לא גדול מדי. במקרה האחרון, את הדיוק להערכת נקבעת במידה רבה את תדירות רקומבינציה בין סמן ונזק רב צורות. שיטות אבחון עקיפות גם לספק צעד מקדים הכרחי של תדרי אלל מחקר האוכלוסייה נתח בקרב מטופלים נישאים של מוטציות, בתוספת ההכרח בקביעת ההסתברות של רקומבינציה של סמני nonequilibrium הידבקות ו אללים מוטנטים.

שיטות אחרות

קטעים קצרים של RNA או DNA, כמו גם גן יחיד מדמיינים תחת מחקר מיקרוסקופי לא יכולים להיות, ולכן, כדי לזהות מוטציות הדרושה אבחון גנטי מולקולרי. ישנו "פרויקט הגנום האנושי", כמו גם ההתקדמות אחרים בגנטיקה מולקולרית הרחיבה מאוד את האפשרות של אבחון של מחלות תורשתיות - הן לפני ואחרי הלידה. שיטות אלה יכולים לספק גילוי מוקדם ולבצע רַב חיזוי ומחלות מונוגניות, הבכורה אשר מתרחש לבגרות. למרבה הצער, בשל היכולות הטכניות של מחקרים גנטיים מולקולריים הם לפעמים מעבר לגבולות האתיים המוגדרים ביחס ירושה, במיוחד כאשר האבחנה היא בגיל התבגרות ילדות.

אנומליות מבניות וכמותיות של כרומוזומים הן הסיבות השכיחות ביותר הן למחלות אונקולוגיות והן להפרעות התפתחותיות רבות. יש לזהות סטיות כרומוזומליות, החשובות לייעוץ משפחתי - כדי להעריך את הפרוגנוזה יחד עם סיכון הרבייה בהריונות עתידיים. ניתוח כרומוזומלי הוא "תקן הזהב" של אבחון גנטי, אך יש לו גם יכולות מוגבלות. רק שיטות של ניתוח גנטי מולקולרי יכולות לעשות יותר, משום שהן משתמשות בתוויות ניאון המבוססות על טכנולוגיות שיבוט, אשר יכולות לזהות עם הרגישות הגבוהה שלהן שינויים כרומוזומליים יפים, שלא ניתן לזהותם על ידי מחקר ציטוגנטי קלאסי . טכניקות אלה מרחיבות יותר ויותר את יכולות האבחון שלנו, כאשר נבדקים ילדים עם פגמים התפתחותיים, עם פיגור שכלי, ועוד מחלות תורשתיות רבות.

מסקנות

חשוב מאוד לאנושות היה הידע על המבנה והתפקודים של הגנים, על סוגי השונות שלהם, על היכולת לזהות מחלות תורשתיות, שהתרחשו בקשר עם התפתחות הגנטיקה המולקולרית. השיטות שלה נועדו לחקור את מולקולת הדנ"א - וכאשר זה נורמלי, ואם הוא פגום. הכנת רצפים נוקליאוטידים של חומצה deoxyribonucleic (DNA) ממשיך צעד אחר צעד מן ההכנה של דגימות לזיהוי של שברי בודדים. בידוד של דנ"א גנומי מהתאים, הגבלה (קריעה), הגברה (שיבוט), אלקטרופורזה של שברי (הפרדתם על ידי מטען חשמלי ומשקל מולקולרי באמצעות ג'ל agarose). זיהוי שברים מסוימים על פני השטח על ידי רצועה נפרדת.

אז מסננים מיוחדים להיכנס במקרה, שבאמצעותו הכלאה של כל שבר עם שברי דנ"א משובטים או עם בדיקות רדיואקטיביות סינתטיים כי הם שליטה, שדרכו כל קטע תחת מחקר יהיה הכלאה. אם המיקום או האורך שלו השתנה ביחס בדיקה, אם קטע חדש הופיע או נעלם, כל זה מצביע על כך הגן הנחקר עבר סידור מחדש ברצף נוקליאוטידים. ישנן שמונה שיטות בסיסיות של מחקר גנטי מולקולרי: רצף (קביעת רצף DNA), תגובת שרשרת פולימראז (הגדלת מספר הרצפים), קבלת פריימרים של גנים ידועים, שיבוט דנ"א, קבלת מולקולות רקומביננטיות, קבלת חלבונים בשל מולקולות רקומביננטיות, יצירת סט שלם (אוספים, ספריה) של שברי משובטים, שהושגו על ידי הגבלה.