מיקרוסקופ פלואורסצנטי: עקרונות השיטה

ספיגה מחדש פליטה של נוזלים אורגניים ואורגניים עוד אור היא התוצאה של זרחני או פלואורסצנטי. ההבדל בין התופעות הוא משך את המרווח בין הקליטה ופליטה של שטף אור. כאשר הקרינה של תהליכים אלה מתרחשים כמעט בו זמנית, תוך זרחני - באיחור.

מידע היסטורי

בשנת 1852, סטוקס מדען בריטי, תאר קרינה ראשונה. הוא הציג מונח חדש כתוצאה של ניסויים עם פלואוריט, אשר פולטים אור אדום תחת אור אולטרה סגול. סטוקס ציין תופעה מעניינת. הוא מצא כי אורך הגל של קרינת פלורסנט הוא תמיד גדול יותר את זרימת אור העירור.

כדי לאשר את ההשערה במאה ה -19 היו ניסויים רבים. הם הראו כי מגוון של דוגמאות לזרוח תחת השפעת האור האולטרה סגול. בין החומרים, בין יתר, היה קריסטלים, שרפים, מינרלים, כלורופיל, סמים גסים, תרכובות אנאורגניות, ויטמינים, שמנים. השימוש הישיר של צבעים עבור בדיקות ביולוגיות החל רק בשנת 1930

מיקרוסקופ פלואורסצנטי: תיאור

חלק מהחומרים המשמשים במחצית הראשונה של המאה ה -20 מחקרים שהוצג סגולי גבוהה. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. בזכות הביצועים, אשר לא יכולים להיות מושגת על ידי שיטות מנוגדות, השיטה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפכה לכלי חיוני למחקר ביורפואי הביולוגי. לא פחות חשובות תוצאות התקבלו, ועבור חומרים.

? מה היתרונות עושה את השיטה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי? שימוש בחומרים חדשים הפך אפשרי ואת הבחירה של רכיבי submicroscopic תא ספציפי מאוד. מיקרוסקופ פלואורסצנטי יכול לזהות מולקולות בודדות. מגוון של צבעים מאפשר זיהוי של פריטים מרובים בבת אחת. למרות הרזולוציה המרחבית מוגבלות לגבול השתברות של ציוד, אשר, בתורו, תלוי את המאפיינים הספציפיים של המדגם, זיהוי של מולקולות מתחת לרמה זו הוא גם מן הנמנע. דגימות שונות לאחר autofluorescence תערוכת ההקרנה. תופעה זו נמצאת בשימוש נרחב פטרולוגיה, בוטניקה, תעשיית המוליכים למחצה.

תכונות

למד רקמות מן החי או פתוגנים קרובות מסובכות או חלשות מדי או חזקות מאוד autofluorescence הנוקב. עם זאת, הערך במחקרים רוכש מבוא לרכיבי החומר מלהיבים אותו אורך גל ספציפי פולט את עוצמת זרימת אור ההכרחית. Fluorochromes לשמש צבעים מסוגלים באופן עצמאי מצורפים מבנים (גלויים או סמויים). לכן יש להם סלקטיביות גבוהה ליעד, ואת התשואה הקוונטים.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. מיקרוסקופ פלואורסצנטי כבר בשימוש נרחב מאז כניסתו של צבעים טבעיים וסינתטיים. הם דיבוק פרופילים בעצימות מסוימים של הפליטה ו עירור ממוקד מטרות ביולוגיות ספציפיות.

זיהוי של מולקולות בודדות

לעתים קרובות, בתנאים אידיאליים, אתה יכול לרשום זוהר אלמנט נפרד. לשם כך, בין שאר, יש צורך לספק רעש נמוך מספיק של הגלאי והרקע האופטי. מולקולה והעמסה לכישלון בשל photobleaching יכול לפלוט עד 300 אלף. פוטונים. בשעת 20% יעילים אוסף של התהליך יכול לרשום אותם בסכום של כ -60 אלף.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוסס על photodiodes מפולת או כפל אלקטרוני, אפשר לחוקרים לבחון את התנהגותו של מולקולות בודדות דרך השנייה, ובמקרים מסוימים אפילו דקות.

המורכבות

סוגיה מרכזית לטובת דיכוי רקע רעש אופטי. בשל העובדה כי רב מן החומרים המשמשים בעיצוב של פילטרים לעדשות תערוכה קצת autofluorescence, המאמצים של מדענים בשלבים המוקדמים היו בכיוון לייצור של רכיבים בעלי קרינה נמוכה. עם זאת, בניסויים עוקבים הובילו למסקנות חדשות. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. בפרט, נמצא כי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, המבוסס על החזרה גמורה, היא מאפשרת להשיג רקע נמוך ואור עירור בעוצמה גבוהה.

מנגנון

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. העקרונות של מיקרוסקופ פלואורסצנטי, המבוססים על ההשתקפות פנימית מוחלטת הוא השימוש גל או חלוף חלוף. זה מתרחש בגבול בין התקשורת עם אחר מדדי שבירה. במקרה זה, את קרן האור עוברת דרך הפריזמה. יש לה פרמטר מקדם שבירה גבוה.

הפריזמה סומך פתרון או זכוכית המימי עם פרמטר נמוך. אם קרן האור מכוון אותו בזווית כי הוא יותר קריטי, הקרן משתקפת לחלוטין מהממשק. תופעה זו, בתורו, גורם גל nonpropagating. במילים אחרות, השדה האלקטרומגנטי שנוצר החודר לתוך מדיום עם פרמטר מקדם שבירה נמוך עד למרחק של פחות מ 200 ננומטר.

גל חלוף עוצמת האור תהיה מספיק כדי להלהיב fluorophores. עם זאת, בגלל העומק הקטן מאוד שלה, נפחו יהיה קטן מאוד. התוצאה היא רקע ברמה נמוכה.

שינוי

מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוסס על השתקפות פנימית מוחלטת, יכול להיות מיושם עם תאורת EPI. זה דורש עדשות עם צמצם מספרי גבוה (לפחות 1.4, אבל זה רצוי שזה הגיע 1.45-1.6), ואת המואר חלקית מנגנון שדה. זה האחרון מושג עם גודל נקודה קטן. לקבלת אחידות רבה יותר באמצעות טבעת דקה, אשר נחסמה על ידי חלק של הנחל. עבור הזווית הקריטית, שאחריה יש השתקפות מוחלטת, אנחנו צריכים רמה גבוהה של שבירה של מדיום טבילת העדשה ואת מכסה הזכוכית של המיקרוסקופ.